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導航
Western Blot檢測蛋白表達步驟及試劑配制
【原理】
一個基因表達的終極結(jié)果是產(chǎn)生相應的蛋白質(zhì)（或酶），因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達的主要標志。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
【實驗步驟】
1、安裝電泳裝置，將玻璃板固定于灌膠支架上，根據(jù)待分離的蛋白質(zhì)分子大小來選擇所需的丙烯酰胺的百分比濃度；
2、分離膠的配制，按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa；
3、將分離膠緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可，在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min（聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線）。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HCl pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干；
4、配制濃縮膠，將濃縮膠倒入玻璃夾層中直至頂部；
5、選擇合適的梳子插入濃縮膠中，室溫放置30min，使其聚合；
6、蛋白質(zhì)變性及點樣：:蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，100°C 加熱5min，使蛋白充分變性；
7、小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液充滿之；
8、將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液；
9、加樣：用50μl注射器將蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS加樣緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散；
10、連接電源，待溴酚藍染料電泳到達凝膠底部為止；
11、關(guān)閉電源并撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，將其用吸水紙吸干，并做好標記，以便識別加樣順序；
12、小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來。小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質(zhì)的檢測；
13、轉(zhuǎn)膜：準備與膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）和六張濾紙，在電轉(zhuǎn)儀上，依次放置已經(jīng)在轉(zhuǎn)移平衡液中平衡過的（順序由下至上）3層濾紙、NC膜、電泳凝膠、3層濾紙，將凝膠面與負極相連，NC膜與正極相連，室溫、220 V轉(zhuǎn)移1 h；

14、清洗：將硝酸纖維素膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動； 

15、封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后立即放到5%脫脂牛奶中封閉2h；（最常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液）

16、一抗孵育：一抗用TBST 1:200（根據(jù)自己實驗）稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時(或4℃過夜)，搖床搖動；
17、清洗：將硝酸纖維素膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘；
18、二抗孵育：二抗用TBST 1:1000（根據(jù)自己實驗）稀釋，將硝酸纖
維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動；
19、清洗：用1×TBST清洗2次，每次5分鐘；
20、顯色：ECL發(fā)光顯色。
【常用試劑】
1、儲備膠（丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺）：應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液，丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml，儲存于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實pH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應，使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。
注意：丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。
2、10%(w/v) SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液:：0.1g SDS，1 ml H2O去離子水配制，室溫保存。
3、分離膠緩沖液[1.5 mmol/ LTris-HCL(pH8.8)]：18.15g Tris和48ml 1mol/L HCL混合，加水稀釋到100ml終體積，過濾4℃保存。
4、濃縮膠緩沖液[0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8)]：6.05g Tris溶于40ml H2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積，過濾4℃保存。
注意：這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris-HCL。
5、10%過硫酸銨(AP)：過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。去離子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應現(xiàn)用現(xiàn)配。
6、SDS-PAGE加樣緩沖液(pH6.8)： 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10% SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水中煮3min混勻后再上樣，一般上樣量為20-25μL，總蛋白量100μg。
7、10×Tris甘氨酸電泳緩沖液：30.3g Tris，188g甘氨酸，10g SDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25 mol/L Tris-1.92 mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。
8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8g Tris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。
9、10×TBST緩沖液：250 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1.25 M NaCl， 0.5% Tween-20。