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1）. 酶標(biāo)儀檢測，酶標(biāo)儀的設(shè)置條件是什么？

需要選擇化學(xué)發(fā)光模式

2）.雙酶檢測范圍

雙酶是在轉(zhuǎn)錄水平上的檢測

3）.轉(zhuǎn)染是瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)？

美侖對應(yīng)檢測的是瞬轉(zhuǎn)的

4）可以用于植物么？

閃光型(MA0517)，只要細(xì)胞充分破碎，都可以用；因?yàn)槭窍忍岬鞍?，再檢測，所以可以用于植物；輝光型(MA0519)，原位裂解肯定破碎不充分，所以才針對哺乳動物細(xì)胞使用，植物最好不用，第一可能裂解不充分，第二沒有數(shù)據(jù)支撐。

Cy5是一種用于標(biāo)記肽, 蛋白質(zhì), 寡核苷酸的氨基基團(tuán)的反應(yīng)染料。 激發(fā)波長 (nm): 648, 發(fā)射波長 (nm): 662. Cy5-NH酯更廣泛應(yīng)用于多肽，蛋白，核苷酸等，還能用于納米材料等；EX激發(fā)波長 646 nm EM發(fā)射波長 664nm；Cy5一般是用水溶解的，如果是易降解的蛋白質(zhì)，當(dāng)使用DMF或DMSO是不可取的，需要用Cy5-NH酯，如需要氨基反應(yīng)探針可選擇Cy5-NH酯，Cy5-NH也可以用水溶。

收到細(xì)胞后, 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常，對于貼壁細(xì)胞則要注意看貼壁情況是否良好，觀察細(xì)胞密度，確認(rèn)細(xì) 胞無異常, 用 75%酒精對培養(yǎng)瓶表面進(jìn)行消毒處理，將培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 3-4 小時(shí)，以恢復(fù)細(xì)胞 狀態(tài)，如果細(xì)胞密度不高，建議過夜培養(yǎng)。若細(xì)胞密度超過 80%，則可以根據(jù)以下提供的傳代步驟進(jìn)行傳代；若細(xì)胞密度未達(dá)到 80%，則先吸除 原來培養(yǎng)瓶中大部分的培養(yǎng)基，留下 5-10ml 左右，稍微擰松瓶蓋，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì) 胞密度超過 80%時(shí)再進(jìn)行傳代。中途如覺得細(xì)胞長的較緩慢，可向培養(yǎng)瓶中添加5%的血清。

酵母培養(yǎng)基是一大類，包括YPD培養(yǎng)基，有些是用酵母粉配置的；具體配置哪種酵母培養(yǎng)基，可以找下對應(yīng)配方。

（1）單線態(tài)氧就是活性氧嗎？

單線態(tài)氧屬于活性氧，是普通氧的激發(fā)態(tài)。單線態(tài)氧雖不是自由基，但因解除了自旋限制所以反應(yīng)活性遠(yuǎn)比普通氧高。

（2）SOSG甲醛溶液滴入水溶液中，會有熒光強(qiáng)度么？

SOSG甲醛溶液滴入水溶液中會有熒光強(qiáng)度的，水也是有單態(tài)氧的，有的話就有熒光強(qiáng)度。

（3）單線態(tài)氧加入甲醇最多能保存多久？

具體時(shí)間不確定，因?yàn)榭諝庵杏醒?，無論是放甲醇中還是粉末，熒光強(qiáng)度都會一點(diǎn)點(diǎn)衰減，放-80低溫衰減的會緩慢一點(diǎn)。

（4）能檢測細(xì)胞里的單線態(tài)氧么？

不可以的，一般細(xì)胞檢測活性氧用DCFH-DA探針較多。

（5）被檢水溶液怎么制備？

用甲醇配成濃度約5mM的儲液，即向每管100μg包裝的小瓶里加入33μL甲醇。使用前立即準(zhǔn)備本試劑的工作溶液，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后丟棄任何多余的稀釋試劑。SOSG單線態(tài)氧熒光探針適用于水環(huán)境，最佳稀釋緩沖液和工作濃度應(yīng)由經(jīng)驗(yàn)確定，一般建議起始濃度范圍是1~10μM。

（1）提取方法，適用范圍

我們外泌體試劑盒MA0403采用沉淀法，沉淀法適合WB檢測，RT-PCR

（2）一次實(shí)驗(yàn)需要多少體積血清/血漿？

至少0.5 ml血清/血漿樣本。更少的血清體積雖也可以提出外泌體，但產(chǎn)量可能較低，不滿足后續(xù)實(shí) 驗(yàn)需求。

（3）本品提取的外泌體如何應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)？

可直接使用下一步實(shí)驗(yàn)的試劑處理離心后的沉淀。例如，可直接加入合適裂解液后，用移液器 吹打或使用勻漿器重懸沉淀后進(jìn)入RNA和蛋白提取流程。如需重懸，可用適量1 × PBS重懸離 心后的沉淀。

（4）血清/血漿外泌體沉淀如何重懸？

血清提取的外泌體沉淀可使用適量1 × PBS或其他下游實(shí)驗(yàn)所需試劑進(jìn)行重懸。沉淀重懸有時(shí) 會較為困難，若后續(xù)實(shí)驗(yàn)對外泌體的完整性無要求，可使用低速勻漿器進(jìn)行重懸。

（5）細(xì)胞提取外泌體的注意事項(xiàng)

1）. 美侖公司MA0402適用于各種類型細(xì)胞培養(yǎng)液上清中外泌體的提取。為防止 FBS 中較多的牛外泌體造成污染，可在 細(xì)胞培養(yǎng)至 50%-70%左右更換無血清培養(yǎng)基或者不含外泌體的血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約 12~48h 后收集 上清使用。也可直接使用不含外泌體的血清培養(yǎng)基直接培養(yǎng)細(xì)胞，后續(xù)直接收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行外泌 體提取。

2）. 一次實(shí)驗(yàn)需要多少體積細(xì)胞培養(yǎng)液取決于上清中外泌體的量，可能受細(xì)胞類型、狀態(tài)、數(shù)目的影響各不 相同，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求決定樣本起始量。

3）. 用固定角度的離心機(jī)離心時(shí)，需標(biāo)記管子的擺放方向。一般樣本中外泌體含量較少，離心后可能肉眼觀 察不到沉淀，標(biāo)記方向后，在重懸時(shí)將 1×PBS 朝離心管靠外側(cè)的內(nèi)壁反復(fù)吹打洗脫即可。

4）. 離心后的沉淀可用 100-200 μL 的 1×PBS 重懸后使用，也可使用下一步實(shí)驗(yàn)的試劑直接處理沉淀。 例如，可直接使用裂解液吹打重懸沉淀后進(jìn)入 RNA、蛋白質(zhì)提取流程。

DAPI是可以通過完整細(xì)胞膜的，可以染活細(xì)胞也可以染死細(xì)胞，但是因?yàn)镈API是半透性的，染活細(xì)胞的效果沒有染死細(xì)胞好。所以DAPI一般用來染固定后的細(xì)胞；Hoechst透膜性比DAPI好，染活細(xì)胞更常用, Hoechst33258容易透過細(xì)胞膜，而Hoechst33342多用于細(xì)胞凋亡檢測，還可以PI和Hoechst33342雙染做流式；另外，Hoechst33342的細(xì)胞毒性比Hoechst33258要小。

市面上現(xiàn)在染料有的存在竄色現(xiàn)象，濃度稍大產(chǎn)生了聚合物沉淀，而改變了發(fā)射波長，建議：可以試下降低染色濃度，調(diào)整一下反應(yīng)條件，這種情況會改善的。

細(xì)菌：青霉素(25-100ug/ml)鏈霉素(25-100ug/ml) 、慶大霉素(10-100ug/ml)

真菌：MB1014兩性霉素B

支原體：MA0340支原體清除試劑；MA0339支原體預(yù)防試劑；MA0144支原體檢測試劑盒

黑膠蟲：一般為血清原因，建議勤換液，PBS清洗，換瓶

熒光顏色不同、波長不同：MB6041為紅色熒光（577nm，590nm），MB6042（504nm，511nm）和MB6043（443nm，505nm）為綠色熒光。

原理不同：MB6041該類探針是對活細(xì)胞酸性區(qū)式進(jìn)行選擇性染色的熒光染料。具有幾大重要的特點(diǎn)，1）選擇性標(biāo)記酸性細(xì)胞器；2）納摩爾級（nM）濃度即可有效標(biāo)記活細(xì)胞；3）具有多色探針提供，可根據(jù)情況對樣品進(jìn)行多標(biāo)實(shí)驗(yàn)。MB6042  LysoTracker結(jié)構(gòu)上由一個(gè)熒光基團(tuán)和相連的弱堿基構(gòu)成，可自由穿過細(xì)胞膜，一般聚集在球形細(xì)胞器上，適用于觀察溶酶體內(nèi)部生物合成及相關(guān)發(fā)病機(jī)理。Lysotracker中性pH下僅僅發(fā)生部分質(zhì)子化，因此該探針標(biāo)記細(xì)胞器的原理可能與其完全質(zhì)子化并滯留在細(xì)胞器膜上有關(guān)。MB6043 LysoSensor系列探針是主要對活細(xì)胞中的酸性區(qū)室（如溶酶體、頂體精子）動態(tài)合成和功能進(jìn)行研究的一類熒光探針，該類探針的染色具有向酸性，可通過質(zhì)子化作用在酸性細(xì)胞器內(nèi)累積。該類探針的這種質(zhì)子化作用還可解除染料的熒光淬滅性，使其所發(fā)射的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。因此，與LysoTracker系列探針相比，LysoSensor系列探針隨著細(xì)胞器的酸化程度其熒光強(qiáng)度呈pH依賴型(向酸)增強(qiáng)。

需注意：MB6042溶酶體綠色熒光探針(LysoTracker Green DND-26) 染色后可以固定，且其維持時(shí)間長，要是做示蹤的話更適合；MB6043溶酶體綠色熒光探針(LysoSensor Green DND-189) 不可固定，其依賴低pH，所以染色后固定會嚴(yán)重影響pH從而嚴(yán)重影響發(fā)光。同時(shí)也因?yàn)?/strong>MB6043隨著細(xì)胞器的酸化程度其熒光強(qiáng)度呈pH依賴型(向酸)增強(qiáng)，故此能看到顏色變化。