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MB6046/MB6044均為線粒體熒光探針，MB6044為綠色熒光（490nm，516nm），MB6046為紅色熒光（579nm，599nm），兩者均可染活細(xì)胞（不能染組織）。與MB6046不同的是，MB6044定位線粒體的能力不受線粒體膜電位的影響，但MB6044不適合于醛類固定，會(huì)使熒光信號(hào)丟失，因此更適合活細(xì)胞染色。而MB6046染色后可根究實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行固定（醛類）和透化（Triton-100），探針依然維持在細(xì)胞內(nèi)，且更適合雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

1、Fura-2 AM的熒光比較弱，最大激發(fā)波長(zhǎng)為369 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為478 nm，并且其熒光不會(huì)隨鈣離子濃度改變而改變；Fura-2 AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fura-2，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fura-2和鈣離子結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為335 nm (最大激發(fā)波長(zhǎng)隨離子濃度的不同而有所不同)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm。

2、Fluo-3 AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會(huì)隨鈣離子濃度升高而增強(qiáng)。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為506 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為526 nm。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525-530 nm。

3、Fluo-4 AM是最常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。Fluo-4 AM將Fluo-3 AM結(jié)構(gòu)中的氯原子替換成了氟原子，導(dǎo)致它的最大激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)向短波長(zhǎng)處偏離10 nm左右。這個(gè)波長(zhǎng)更接近于氬激光器的波長(zhǎng)488 nm，所以用氬激光器激發(fā)時(shí)，F(xiàn)luo-4的熒光強(qiáng)度會(huì)比Fluo-3強(qiáng)一倍，F(xiàn)luo-4可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為516 nm。Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針) 是配制于無水DMSO (anhydrous DMSO)中的儲(chǔ)存母液，濃度為2mM。

（1）Annexin V/PI試劑盒為什么用不含EDTA胰酶？

Annexin V 是 Ca 依賴性蛋白， 所以不能加入 EDTA， 防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V， 進(jìn)而影響結(jié)果。

（2）Annexin V/PI試劑盒做單染用普通細(xì)胞還是凋亡細(xì)胞？單染一定要做么？

單染一定要做，需要畫十字門調(diào)補(bǔ)償單染可以用正常細(xì)胞做，但是正常細(xì)胞凋亡有的比較少，畫門可能不是很清晰；建議設(shè)置經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的正常細(xì)胞、PI 單染和 Annexin V-FITC 單染 3 個(gè)對(duì)照組，正常細(xì)胞組可作為熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。結(jié)果可用 CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC 為橫坐標(biāo)，PI 為縱坐標(biāo)。

（3）凋亡試劑盒Annexin V款受不受GFP等干擾？

美侖凋亡試劑盒有三款，Annexin V-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(50T)；其中貨號(hào)MA0220，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，F(xiàn)ITC發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光；貨號(hào) MA0428 AnnexinV-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中，將PI更換為了 7-AAD，也發(fā)紅色熒光，但其發(fā)射光譜較PI窄，且發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更?。回浱?hào)MA0429 AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，選擇PE（MB5943藻紅蛋白）與Annexin V 偶聯(lián)，其中PE 的激發(fā)波長(zhǎng)為為495,545或565nm ,發(fā)射波長(zhǎng)575nm,發(fā)出紅色熒光，在多色熒光分析中，在待檢測(cè)的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)GFP等綠色熒光蛋白的情況下，推薦客戶選購(gòu)Annexin V PE/7-AAD試劑盒。

（4）Annexin V-FITC/PI可以做貼壁細(xì)胞原位熒光檢測(cè)嗎?

美侖Annexin V-FITC/PI可以做原位熒光檢測(cè)，注意：一定要用試劑盒里的buffer；染料加量適當(dāng)提高。

（5）單純檢測(cè)磷脂酰絲氨酸暴露的情況，不需要染核，可以用Annexin V/PI（MA0220）試劑盒么？

可以用的，不染核的話,不用PI就行了

(6) 細(xì)胞活力(活死細(xì)胞染色)檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒有什么區(qū)別？

細(xì)胞活力(活死細(xì)胞染色)檢測(cè)試劑盒（MA0361）是區(qū)別活細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞總數(shù)；死細(xì)胞包括：壞死，死亡，凋亡； 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（MA0220）可以區(qū)別出活細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞，壞死細(xì)胞

（7）TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒適用于組織切片嗎？

可以用于組織切片，如果是新鮮組織，需要固定液固定，做成切片

（8）Tunel實(shí)驗(yàn)，加抗熒光衰減封片劑之后怎么保存呢？能保存多久？

常溫；避光放就行；保存時(shí)間具體得看熒光，但是熒光總會(huì)衰減；一般兩三天沒問題。

（9）Tunel怎么計(jì)算凋亡指數(shù)?

在共聚焦下,凋亡率(凋亡指數(shù))的計(jì)算方法如下:每個(gè)樣品隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，按公式計(jì)算 凋亡指數(shù)(AI)：AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)／(凋亡細(xì)胞數(shù)十正常細(xì)胞數(shù))。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用x土s表示，多組樣本均數(shù)用單因素方差分析，組間兩兩比較用Scheffe檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn).

（10）臺(tái)盼藍(lán)/活死細(xì)胞染色試劑盒區(qū)別

活死細(xì)胞染色試劑盒：Calcein AM是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的優(yōu)良染色試劑，其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。胞內(nèi)的酯酶會(huì)將其水解為Calcein(鈣黃綠素)留在胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光；而碘化丙啶（PI）不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，但其能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（激發(fā)：535 nm，發(fā)射：617nm），從而對(duì)死細(xì)胞染色。是基于鈣黃素AM和碘化丙啶（PI）的活死細(xì)胞染色試劑盒，可用于動(dòng)物細(xì)胞樣品的活力和毒性檢測(cè)。而臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞活性染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性，還常用于檢測(cè)細(xì)胞是否存活。活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色。

（11）細(xì)胞周期試劑盒（MA0334）細(xì)胞染色時(shí)間到了，但是來不及上流式怎么辦？

可以先固定，加入 1ml PBS 充分重懸，成單細(xì)胞，輕輕邊渦旋邊緩慢滴加 3ml 預(yù)冷的無水乙醇，至 終濃度 75%，4℃固定 4h 以上，或者 4℃靜置過夜（18-24h）效果更佳。固定后的細(xì)胞 可以-20℃保存一個(gè)月，之后檢測(cè)時(shí)離心即可。

（1）CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)0.5-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

（2）哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK-8的測(cè)定？

當(dāng)有氧化還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK-8的測(cè)定，因此當(dāng)所加藥物為氧化還原性物質(zhì)時(shí)需要換液再進(jìn)行檢測(cè)。

（3）CCK-8試劑盒如何設(shè)定空白對(duì)照？

在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

（4）CCK-8試劑盒鋪板細(xì)胞量有什么要求嗎？

96孔板細(xì)胞計(jì)數(shù)的時(shí)候一般是104，我們鋪96孔板，細(xì)胞濃度是5*104，取100ul鋪板;可以您自己對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，保證每孔細(xì)胞數(shù)量一致?；蛘呖梢杂?jì)數(shù)，方法：按不同細(xì)胞數(shù)鋪板，貼壁后加cck，孵育1小時(shí)，然后檢測(cè)，OD值在1.5左右是最佳鋪板數(shù)

（5）CCK-8試劑盒反映時(shí)間怎么確定？數(shù)值必須是1么？

0.1-2.5都可以，最佳是1.0左右

（6）CCK-8試劑盒細(xì)胞能一邊培養(yǎng)一邊檢測(cè)？

培養(yǎng)一段時(shí)間測(cè)CCK-8，然后換液后可以接著養(yǎng)。

（7）做CCK-8經(jīng)常有氣泡，對(duì)吸光度有影響，有什么辦法去除么？

有氣泡，沒辦法去除，但是可以避免有氣泡，加藥時(shí)槍頭抵著孔壁，慢點(diǎn)加液體，基本不會(huì)產(chǎn)生氣泡，如有條件可將96孔板離心，這樣氣泡就會(huì)消失

（8）CCK-8試劑盒OD值偏高？

可以確認(rèn)下培養(yǎng)時(shí)間，一般肉眼可見顏色變化即可檢測(cè)

（9）CCK-8除了用酶標(biāo)儀還可以用什么儀器？紫外分光光度計(jì)行么？

一般CCK-8都是用酶標(biāo)儀，紫外分光光度計(jì)最好不用，因?yàn)樽贤馕覜]記錯(cuò)一次只能測(cè)一個(gè)孔吧，而且還得把孔內(nèi)液體吸出來到紫外用的皿里，而且檢測(cè)時(shí)間很長(zhǎng)，CCK-8對(duì)孵育時(shí)間敏感，這樣誤差太大了

（10）CCK-8會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡嗎？

CCK-8本身對(duì)細(xì)胞毒性特別小，作用時(shí)間長(zhǎng)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞都死亡，但是細(xì)胞長(zhǎng)滿了，本身代謝會(huì)引起細(xì)胞死亡

（11）CCK-8試劑盒每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會(huì)有以下幾個(gè)原因：

1)當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。

2)有可能會(huì)因?yàn)镃CK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3)每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請(qǐng)預(yù)先在1,000~100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。

4) 重復(fù)試驗(yàn)請(qǐng)保證孵育時(shí)間、接種細(xì)胞數(shù)相同。

(12)CCK-8試劑盒和EDU試劑盒區(qū)別：

如檢測(cè)單個(gè)藥的毒性推薦EDU，EDU檢測(cè)增殖最準(zhǔn)確的方法,因?yàn)樗菣z測(cè)DNA合成情況的，cck因?yàn)榘殡S代謝，有些藥物影響到代謝，所以有時(shí)候最后測(cè)得的抑制率并不一定是和細(xì)胞毒性成正比的；但是DNA變化是準(zhǔn)確的，而且可以用于流式     

如前藥物篩選化合物多的話建議用CCK-8,因?yàn)閑du操作步驟比較復(fù)雜，不適合前期藥物篩選，cck反映速度快，操作簡(jiǎn)單，適合前期實(shí)驗(yàn)

（13）EDU細(xì)胞孵育時(shí)間怎么確定？

時(shí)間可以去ATCC上看下細(xì)胞倍增時(shí)間，通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。

（14）3%BSA作用是什么?

3%BSA作用封閉穩(wěn)定熒光

（15）EDU試劑盒做流式怎么收集細(xì)胞呢？固定的細(xì)胞都是碎片了?

孵育完edu之后收集細(xì)胞，然后在固定，之后按照懸浮細(xì)胞往后做，每步均需要離心3200rpm/5min

（16） EdU染色之后，先用熒光顯微鏡測(cè)一下，再進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，再測(cè)一次呢，還是胞核染好了一起測(cè)就行？

都可以，可以染完edu，先用顯微鏡看下，然后在核復(fù)染，再看下；也可以染完edu，直接染核，然后在不同波長(zhǎng)刺激下看。

（17）染完了要立即用熒光顯微鏡觀察嗎，可以放多久？

最好立即看，因?yàn)闊晒庥锈?，如果想保存一段時(shí)間可以加封片劑，但是也建議先看一下在加封片劑，在觀察，因?yàn)榧臃馄瑒晒庖彩怯兴p的，肯定沒有剛?cè)就甑暮?

（18）洗滌液通透液怎么配？

洗滌液是3gBSA加100ml的PBS；通透液TritonX是液體，也就是0.4ml到100mlPBS，配完放4度就行。

(1) 內(nèi)參過爆

大連美侖ECL是飛克級(jí)的，靈敏度比較高，內(nèi)參蛋白的話，建議使用的時(shí)候減少ECL用量，如果能調(diào)節(jié)時(shí)間的話，盡量時(shí)間短一些，如果手動(dòng)曝光的話就1-2s就可以，一抗洗膜時(shí)間和洗膜次數(shù)可以適當(dāng)延長(zhǎng)

（2）曝光磷酸化蛋白比較模糊

可能原因：

1）因?yàn)榱姿峄鞍妆旧砗烤蜕?，特異性在不好，很容易出現(xiàn)這樣的條帶，抗體一定要買好一點(diǎn)的

2）目的蛋白如果較大，轉(zhuǎn)膜時(shí)間要延長(zhǎng)，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)間

3）適當(dāng)調(diào)高一抗二抗稀釋倍數(shù)

4）磷酸化封閉用tris體系的BSA，封閉時(shí)間可以長(zhǎng)一點(diǎn)。

（3）預(yù)制膠兩邊marker有些傾斜或者不在同一條線上

預(yù)制膠存在邊緣效應(yīng)，樣本允許的條件下可以把兩邊空出來，或者上一些廢樣做保護(hù)

（4）樣本-20℃放了一年了，還能用么？效果會(huì)不會(huì)有影響？

組織久了，效果會(huì)有點(diǎn)影響，但是不好說影響大不大，WB也是需要看具體蛋白情況，有些蛋白可能就是不好跑，您可以先做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，挑選幾個(gè)樣本，跑個(gè)內(nèi)參，看下蛋白彌散不？如果彌散了其他目的蛋白肯定也不好了，如果不彌散，還可以的話可以做下目的蛋白，但這個(gè)檢測(cè)只能說明樣本還能跑蛋白，但是不保證每個(gè)目的蛋白都一定能跑好

（5）loading buffer 加沒加蛋白酶抑制劑？

美侖的loading buffer 沒加蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑是在蛋白提取的時(shí)候加的，這只是一個(gè)上樣的緩沖液；緩沖液在沒有稀釋前，有高濃度的變性劑，蛋白酶是無法存在的

（6）蛋白印記膜再生液能否重復(fù)用？

試劑pH很重要，重復(fù)用會(huì)使pH升高，效果減弱，建議不要重復(fù)使用

（7）預(yù)制膠需要壓樣么？可以直接跑嗎？

美侖預(yù)制膠不用壓樣，直接跑就可以，電泳條件：150 V，30-40 min，當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶電泳至凝膠底部，或?qū)嶒?yàn)預(yù)定位置時(shí)，即可結(jié)束電泳。如果想得到更加清晰平直的條帶，可降低電壓至 100-120V，并適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間。當(dāng)然壓樣也可以，條帶可能會(huì)更加好看。

（8）sds-page用預(yù)制膠跑完不在一條線上？

可能原因：樣品的蛋白濃度或者離子影響了遷移速度，上樣量一樣，但是蛋白濃度不一樣，那么蛋白量就不一樣，蛋白的量相對(duì)越多，跑的越慢，但是做蛋白表達(dá)不影響結(jié)果的；或者也可以：如果蛋白濃度差的多建議調(diào)整濃度，可以讓蛋白量一致（比如都是20ug，根據(jù)蛋白濃度），調(diào)上樣量，差的多的可以用上樣緩沖液補(bǔ).

（9）sds-page用預(yù)制膠跑完條帶有點(diǎn)彎曲？

電泳的時(shí)候保證內(nèi)槽液體不漏液，降低電泳電壓，濃縮膠60V，分離膠80V,，如果方便可以放些冰塊降溫，上樣前，樣品重新煮一下，冷卻離心，取上清

（10）sds-page用預(yù)制膠跑條帶出現(xiàn)笑臉。

可能原因：電壓高，遷移快，兩邊比中間慢，其實(shí)正常，想要改善可以調(diào)電壓到80V。

（11）sds-page用預(yù)制膠跑條帶出現(xiàn)哭臉

可能原因：蛋白堵塞，樣本可能是有雜質(zhì)堵住了膠孔，改善制樣過程。

（12）預(yù)制膠電泳槽內(nèi)槽加滿電泳液后，如看到個(gè)別膠孔里有絮狀物

用注射器或其他工具吸取電泳液輕輕吹打加樣孔，以去除加樣孔內(nèi)殘留的儲(chǔ)存緩沖液和雜質(zhì)，后在正常上樣。

（13）預(yù)制膠跑膠過程出現(xiàn)黃化

麻煩核對(duì)一下電泳緩沖液，美侖預(yù)制膠HEPS體系，不可使用tris-甘氨酸體系緩沖液，1X 變性凝膠電泳液參考配方為：100 mMTris, 100 mM HEPES, 0.1% SDS, 2 mM EDTA。

（14）預(yù)制膠適用于哪些儀器？

美侖預(yù)制膠兼容性強(qiáng)，兼容目前市場(chǎng)各種mini電泳槽, 包括：Bio-Rad Mini-PROTEAN (II/3 /Tetra System)；Hoefer Mighty Small (SE250/SE260/SE280)；Life Technology Novex Mini-Cell (請(qǐng)與免費(fèi)提供的特制擋板配合使用)；北京六一 DYCZ-25E、DYCZ-24DN、DYCZ-24K、DYCZ-24KS、DYCZ-24KF；君意東方 JY-SCZ2+；天能 VE180；以及其它膠板寬度在10cm的電泳槽。如是伯樂款儀器可以參考說明書中膠條反裝，或者購(gòu)買伯樂款專用

（15）裂解蛋白，呈果凍狀，還有點(diǎn)膠狀呢？

離心時(shí)間過長(zhǎng)，基因組出來了，正常離心后，取上清就可以，DNA會(huì)在沉淀里面，12000rpm，或者重提的話裂解時(shí)間縮短一些。

（16）麗春紅染膜效果不好？

可能原因

1）膜上蛋白太少了，麗春紅識(shí)別率是要低于曝光的，可以正常曝光看下結(jié)果。

2）如果染膜之前用牛奶封閉過，封閉的蛋白染膜是不會(huì)在膜上的

部分產(chǎn)品由于本身熔點(diǎn)，自身性質(zhì)，就是液體狀態(tài)，例如肉桂醛，常溫就是液體。

因?yàn)榉勰┰谝后w中有一定的溶解度，尤其有的粉末用有機(jī)試劑溶解后需要用PBS，水稀釋，而產(chǎn)品本身不溶于水，這時(shí)候稀釋就會(huì)有析出，可以母液配置完成后超聲一下，稀釋之后再超聲水浴一下，這樣基本可以溶解；如析出的結(jié)晶依然存在，那就是溶解度達(dá)不到，需要調(diào)整下溶解度。

（1）超聲水浴加速溶解（2）如果是灌胃方式給動(dòng)物可以混懸液（3）可以選一些助溶劑例如PEG300，吐溫80等。

同一產(chǎn)品不同批次之間存在差異，這是正常現(xiàn)象，麻煩以收到本次產(chǎn)品的COA為主。

如果您購(gòu)買的產(chǎn)品的量非常小，同時(shí)有些產(chǎn)品在凍干的過程中粘附在管壁上形成薄薄的一層，可能觀察不到產(chǎn)品的存在。您可以加入指定溶劑（參照操作手冊(cè)）并渦旋或超聲震蕩使之完全溶解。

對(duì)于蠟狀或油狀的產(chǎn)品很難取出稱量它們的質(zhì)量，我們建議您用合適的溶劑直接溶解該化合物；對(duì)于具有吸濕性的化合物，暴露在空氣中會(huì)吸收水分，呈現(xiàn)液滴狀，這種產(chǎn)品需要放置在干燥器中保存。